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有没有人知道如何用气相色谱仪或高效液相色谱测定有机酸？ 休 闲居编 辑 >>>>>>>>休闲养生网回答： 1 引 言 采用高效液相色谱(HPLC)法分离单糖和寡糖，较多采用氨基柱，乙腈和水作为流动相，此法具有完全分离麦汁、发酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖的优点。本文采用Hypersil NH2柱分析麦汁、发酵液和啤酒中三糖以内的可发酵糖。 至今尚未见到采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法分离测定啤酒中的各种有机酸的报道，本文采用直接RP-HPLC法，应用Nucleosil C18柱，测定啤酒、发醇液和麦汁中的草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸。 2 实验部分 2.1 药品和试剂 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、木糖、草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、磷酸氢二钾药品均为分析纯，乙腈为色谱纯。 2.2 仪器与色谱条件 PE200系列高效液相色谱仪(PE公司)；PE200系列泵，ISS200自动进样器，PE101柱炉。(1)可发酵糖 色谱柱：预柱PE PEEK-C18 4.6 mm×10，分析柱Hypersil 5 μm NH2 4.6 mm×250;柱温：30℃；示差折光检测器；流动相：重蒸＋水，流速1 mL/min，进样量均为10 μL。(2)有机酸 色谱柱：预柱PE PEEK-C18 4.6 mm×10,分析柱Nucleosil 5 μm C18 4.6 mm×250；柱温：18℃；二极管阵列检测器检测波长215 nm；流动相：0.1 mol/L磷酸氢二钾，流速0.8 mL/min，进样量均为50 μL。 2.3 样品前处理 测试样品需在室温20±0.5℃平衡后取样，啤酒和发酵液样品纸滤后再膜滤，取入样品瓶后直接进样；麦汁杀菌后离心取上清液依浓度而稀释，先纸滤后再膜滤，取入样品瓶直接进样。 2.4 定性定量方法 (1)可发酵糖 以保留时间(Rt)和标样添加定性，外标法和内标法定量。(2)有机酸 以保留时间、标样添加和各有机酸紫外吸收光谱来定性，外标法定量。 3 结果与讨论 3.1 可发酵糖测定方法 (1)方法的线性关系和最小检测限 配制一定浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖，进样体积1 μL～100 μL，进样量C微克(μg)与峰面积(A）之间建立回归方程：以上各种糖的线性范围、回归方程及相关系数r分别为：果糖5～100 μg，C=0.6631+7.642×10－6A,r=0.9999；葡萄糖50～100 μg,C=2.8024＋6.601×10－5A，r=0.9992;蔗糖 5～50 μg,C＝0．1274＋8．173×10－6A，r=0.9995；麦芽糖32～320 μg,C＝4．4336＋8.402×10－6A，r=0.9997;麦芽三糖6～120 μg，C=2.3689+8.763×10－6A，r=0.9993，最低检出限量分别为0.2685 μg、0.1844 μg、0.2261 μg、0.3585 μg、0.427 μg。(2)方法的精密度(内标计算) 以木糖为内标，配制一定浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖混合标样，采用单点平均校正因子，同一样品重复进样6次，计算平标准偏差和相对标准偏差，结果为：标准偏差＜0.03；相对标准偏差＜0.4％。(3)方法的回收率 对已知含量的样品添加一定量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖，计算回收率，结果为：97.2%～99．9％。（4）分析样品时内标法与外标法测定结果的比较 同一样品内标法和外标法测定结果的比较，说明测定三糖以内的糖类，二种定量方法均可采用。(5)结论 采用Hypersil NH2柱，以重蒸水和乙腈作流动相，以保留时间和标样添加法定性，外标法和内标法定量，测定麦汁、发酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及麦芽三糖，此法已用于实际样品的测定。 3.2 有机酸的测定方法 (1)定性方法 啤酒中各有机酸保留时间的相对标准偏差＜1.4%；加入纯标样于啤酒中；对照峰高，如试样某一组分的峰高增加，表示试样中可能含有所加入的组分；啤酒中各有机酸紫外吸收光谱：草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸在210～215 nm处均有吸收，草酸、丙酮酸和延胡索酸在254 nm处亦有吸收，其它有机酸254 nm处无吸收。(2)定量方法的精密度和回收率取有机酸混合标样，采用单点平均校正因子，混合有机酸标样重复进样5次，采用平均校正因子，定量测定啤酒和加标啤酒样品，取5次测定值(g/100 L)，计算相对标准偏差及回收率，结果为：各有机酸的相对标准偏差＜2.3%，回收率89.4%～107．8％。可见采用Nucleosil C18柱，二极管阵列检测器，以磷酸二氢钾为流动相，等速洗脱，以保留时间和标样添加及各有机酸的紫外吸收光谱定性，采用平均校正因子外标法定量，此方法适于分析啤酒、发酵液和麦汁中的草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸。 |