如何制备结核杆菌探针？。。。。
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  发布时间：2008-07-31 14:35:44

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休 闲 居 编 辑

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　　1　材料和方法

　　1.1　一般资料

　　1.1.1　菌种和质粒　本研究所用分支杆菌标准菌株来源于中国药品生物制品检定所；大肠杆菌和质粒pUC19来源于军事医学科学院八所；星状诺卡氏菌由中科院微生物研究所提供。

　　1.1.2　工具酶　碱性磷酸酶为Boehringer产品，Klenow酶为New England Biolabs产品，其余均为华美生物工程公司进口分装品。

　　1.1.3　化学试剂　普通琼脂糖购自华美和北京中山生物技术有限公司，随机引物为Boehringer产品，［α-32P］ dATP为Promega Biotech公司产品，其余试剂为国产分析纯。

　　1.1.4　硝酸纤维膜(孔径为0.45um)　北京化工学校和浙江黄岩人民化工厂产品。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细菌培养　将受试分支杆菌和非分支杆菌接种于适当培养基上培养。

　　1.2.2　DNA分离、纯化　收集分支杆菌菌体，悬浮于2mg/ml溶菌酶溶液中，37℃孵育2h。加链霉蛋白酶E和SDS分别至终浓度1mg/ml和1%(w/v)，在60℃孵育2h以上。用苯酚：氯仿抽提后，加乙醇离心沉淀，将沉淀溶解于适量的TE缓冲液中。质粒pUC19 DNA的分离、纯化参考Maniatis等［4］的方法。

　　1.2.3　限制性内切酶消化DNA和琼脂糖凝胶电泳　限制性酶切反应按照厂家推荐的方法进行，于65℃加热5min终止反应。以EcoRⅠ和HindⅢ消化的λ-DNA为对照，消化的DNA在0.7%或1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下观察、照相。

　　1.2.4　DNA片段的回收技术　通过电洗脱法回收。Bio-Rad电洗脱回收仪回收法：按厂家介绍的方法进行。透析袋回收法：参照刘宗正介绍的方法［5］。

　　1.2.5　重组质粒基因库的构建及筛选　用限制性内切酶PstⅠ消化人型结核杆菌H37Rv DNA，回收2～8Kb的DNA片段，按Maniatis等介绍的方法［4］，与PstⅠ消化并经小牛肠碱性磷酸酶处理的载体pUC19重组并转化大肠杆菌JM83，用麦康凯培养基初步筛选转化子，获得的白色菌落用人型结核杆菌H 37Rv全染色体DNA探针通过DNA：DNA杂交反应进一步筛选阳性克隆。

　　1.2.6　探针标记技术

　　(1) 缺口翻译法：参考Maniatis等介绍的方法，取回收的DNA片段lμg左右，用［α-32P］dATP 30uCi进行标记，探针的比活性约为3-4×107cpm/μg.

　　(2) 随机引物法：由军事医学科学院八所方继明教授根据厂家推荐的方法建立。一般取回收DNA片段50～200ng，用［α-32P］dATP 20uCi进行标记，探针的比活性约为1010-1011cpm/μg。

　　1.2.7　制备DNA斑点杂交膜和菌落杂交膜　参照Bhattacharya［6］等介绍的方法制备。

　　1.2.8　杂交反应和放射自显影　杂交液中探针强度为107-1010cpm，杂交温度为37℃。杂交后置-20℃放射自显影6h～3d。

　　1.2.9　Southern转移　根据刘宗正介绍的方法［5］，将DNA转移到硝酸纤维膜上(孔径0.45μm)与探针杂交。

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