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有关哮喘病的基因治疗 上海第二医科大学附属瑞金医院呼吸内科（200025）李伟杰 综述 邓伟吾 审校 摘 要 支气管哮喘是一种气道的慢性炎症性疾病，具有遗传易感性，目前治疗尚不够令人满意。基因治疗有望成为未来治疗该病的一种方法，本文就这方面的情况作一介绍。 关键词 支气管哮喘；基因治疗 支气管哮喘（哮喘）作为一种常见病，近年来其发病率和病死率都有上升趋势。目前认为哮喘是一种气道的慢性炎症，治疗上以激素效果最佳，但是长期应用激素可带来严重的副作用，并且有些严重病例用激素不能很好控制，还有少数患者激素治疗无效（激素抵抗型哮喘），因此有必要寻求新的治疗哮喘的方法。哮喘分子遗传学的研究显示，哮喘是一种多基因参与的具有遗传易感性的疾病，因此通过基因治疗哮喘将为哮喘的防治开辟一条新道路。已有学者在这方面进行了探索。本文就哮喘基因治疗方面的情况作一综述。 1 哮喘的发病机制及分子遗传学概述 哮喘的发生是遗传因素与环境因素（过敏原反复接触、感染、冷空气、运动及烟草烟雾等）相互作用的结果。其确切发病机制尚不清楚，免疫反应异常在其发病过程中可能起重要作用。过敏性哮喘患者接触过敏原后，T淋巴细胞激活，增殖分化为Th2细胞，产生IL－4、IL－5、IL－6、IL－IO、IL－13、GM－CSF、TNFα等细胞因子，促进B细胞增殖及Ig类型转换，产生IgE，IgE与肥大细胞及嗜碱性粒细胞膜上IgE Fc受体结合，当再次接触过敏原时，过敏原与肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面IgE结合，相临的Fc受体发生桥联，使细胞脱颗粒，释放出组织胺、PAF、蛋白水解酶、激肽原酶、嗜酸性粒细胞趋化因子（ECF）、中性粒细胞趋化因子（NCF）及花生四烯酸代谢产物（LTB4、PGD2、LTC4、LTD4等），其中一些物质立即引起支气管收缩，发生速发型哮喘反应（IAR）；同时，在ECF、NCF、LTB4等趋化因子作用下，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及单核一巨噬细胞向气道壁浸润，并被激活，释放出更多的炎症介质（氧自由基、PAF、ECP、MBP及花生四烯酸代谢产物等），引起微血管渗漏、粘膜水肿、腺体分泌增加、上皮损伤、通气障碍和气道高反应性，这往往发生在接触过敏原后数小时至数十小时，因此称为迟发性哮喘反应（LAR）。在哮喘的发病过程中，内皮细胞及气道上皮不仅是炎症损伤的部位，也通过释放各种活性物质在气道炎症的发生中起一定作用。 人们很早就从哮喘的家系分析中发现，哮喘是一种具有遗传易感性的疾病。近年来随着分子生物学的飞速发展，哮喘的分子遗传学研究取得了很大的进步，国内外学者在这方面已进行了较多的研究，其中主要集中在参与免疫反应的基因方面，包括人类白细胞抗原基因（位于6p），T细胞抗原受体a/δ链基因（14qll.2），细胞因子基因簇（5q31一32）及IgE高亲合力受体β亚单位基因（11q13），这些研究的结果显示，这些基因（多态性、突变或异常表达）与哮喘有一定相关性存在。另外，有研究显示，某些基因的多态性（β肾上腺素受体及IL－4基因启动子序列）与哮喘严重程度相关，但这些结果尚有待于进一步研究证实。 2 哮喘基因治疗策略 基因治疗是指运用DNA重组技术设法修复或调节细胞中有缺陷基因，使细胞恢复正常功能，以达治疗疾病的目的。主要的方法有原位修复有缺陷的基因、用正常基因替代有缺陷的基因、添加基因、基因封闭等。哮喘的分子遗传学显示，哮喘是一种有多基因参与的遗传性疾病，因此不可能进行象肺囊性纤维化一样的单基因治疗。有研究表明，哮喘与FCεRIβ基因、β2肾上腺素受体基因及IL－4基因启动子等基因突变或多态性有关，若这些结果得到证实，这些基因位点将成为基因治疗的靶位点，通过基因修复或替换而达治疗哮喘的目的。另外，抑制促炎细胞因子基因或炎症介质代谢过程关键酶基因的表达，或转入IFNγ及1L－－12等抑制TH2免疫反应细胞因子的基因，使它们在肺部表达，也可达到控制哮喘的目的。选定了目的基因，运用分子生物学技术分离、纯化基因，基因重组，然后通过载体转入体内，这就是基因治疗的全过程。真核细胞中的基因转移方法主要有理化法和病毒转移法。呼吸道有极大的被覆上皮的表面积，因此可以上皮细胞作为基因治疗的靶细胞，通过雾化吸入方式将目的基因转入，这样不仅可以保证使目的基因在肺脏局部发挥作用，还可以减小由体循环注入引起的副作用。另外，也可体外转染淋巴细胞或单核一巨噬细胞，然后再回输体内，使其在肺部释放出目的基因编码蛋白，调节机体免疫反应。 3 哮喘基因治疗的研究 3.l 转入抑制变态反应的细胞因子基因Thl／Th2平衡在免疫调节中起着重要作用，已证实，哮喘患者存在着T细胞向Th2细胞的优势转化，这种优势的Th2免疫反应在哮喘发病机制中起重要作用。IL-12可诱导T细胞向Thl细胞方向转化，Thl细胞产生的细胞因子IFNγ可抑制Th2细胞因子的产生，因此转入这些细胞因子的基因，使它们在体内表达，从而可达到治疗哮喘的目的。Hogan等用病毒载体向致敏小鼠气道粘膜转染IL-12基因后发现，IPNγ表达增加，Th2细胞因子产生明显受到抑制，气道反应性明显减低，同时由于细胞介导免疫的建立，气道病毒感染很快得到控制。Li等在过敏性哮喘的小鼠模型上也发现，向气道粘膜转染IFNγ基因，可引起气道上皮IFNγ显著表达，从而抑制抗原和Th2细胞诱导的肺部嗜酸性粒细胞浸润和气道高反应性。Ohkawara等用重组腺病毒载体向卵蛋白致敏小鼠转染IL－10基因，发现支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞数及IL－5水平显著下降，气道炎症明显减轻。 3.2 DNA接种 DNA接种是近年来发展起来的一种安全有效的免疫治疗方法。DNA接种可以诱发Thl引导的免疫应答（细胞免疫），并对Th2引导的免疫应答起抑制作用。主要有CpG DNA接种、过敏原DNA接种等形式。细菌DNA含有大量非甲基化的CpG序列（70％～90％非甲基化），而脊推动物DNA含有很少的CpG序列，并且绝大部分已甲基化（5％非甲基化），模拟细菌DNA，体内注入CpGDNA序列，可使B细胞，自然杀伤细胞IFNγ分泌增加，诱导Thl细胞分化。 CpGDNA需要有一定的寡核苷酸顺序，并且要有8～3O或更多的寡核苷酸才能引起免疫刺激作用。Broide等研究发现，DNA免疫可以减轻嗜酸细胞浸润、气道高反应性和IL－5的产生。SUr等的研究进一步证实了上述结果，认为CpGDNA接种可防治变态反应性肺部炎症。过敏原DNA接种或过敏原DNA和CpGDNA一起接种可引发特异的Thl免疫应答，从而对该过敏原引起的过敏反应起保护作用。Raz争的研究发现，用编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β一gal）的质粒DNA免疫小鼠可引起特异的Thl免疫应答，而β-gal免疫动物可引起对同一抗原的Th2免疫应答，质粒β-galDNA皮内注入β-gal致敏小鼠可使特异性的IgE水平下降66％～75％。Spiegelberg等的研究也发现了基本相似的结果。 有研究表明，用HDM抗原的质粒DNA对大鼠进行肌肉注射，可明显阻止雾化吸入HDM所致的IgE的合成、组织胺释放和气道高反应性。 3.3 反义寡核苷酸 反义寡核苷酸是一种单链核苷酸，一般为15～24个碱基，可特异地与目的蛋白的mRNA结合，使翻译受阻，从而起到基因封闭作用，也是较常用的一种基因治疗或称为基因后治疗方法，具有高效、特异、设计方便、副作用小等优点，目前亦有用于哮喘实验性治疗的报道。考虑到腺苷在哮喘发病中可能起一定作用，Nyce等用针对腺苷A1受mRNA的反义寡核苷酸雾化吸入治疗哮喘的兔模型，结果发现，雾化吸入后，腺苷及屋尘螨（HDM）引起的气道收缩明显减轻。 3.4 其它过敏原与B细胞表面IgE结合，可引起细胞的增殖、活化和IgE产生，因此清除表达膜IgE的B细胞可达控制哮喘发作的目的。Lustgarten等转染整合有非过敏性抗IgE抗体可变区编码序列的TCR基因T细胞，使T细胞表达IgE抗体，结合B细胞表面IgE，从而长期持续清除lgE产生细胞，避免过敏反应的发生。免疫细胞激活后，诱发转录因子，如AP－l复合体（jun／fos或jun/jun）和核因子κB（NF－κB）基因的表达，进一步诱发各种细胞因子的产生，同时这些转录因子还可抑制激素受体基因的表达，在激素抵抗到哮喘的发病过程中起一定作用，因此抑制转录因子基因的表达，在哮喘的治疗中亦可能起一定作用。Wrighton等用腺病毒载体转染I－kBα（转录因子NF－κB抑制剂）基因，内皮细胞转染这种基因后，脂多糖刺激所致内皮细胞激活明显受抑制，VCAM—l、IL－l、IL－6、IL－8等的合成明显a减少，从而可能在哮喘治疗中起一定作用。 休 闲居 编辑 |