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国外医学专家对羟基它里宁的论文报道 第一篇 休 闲 居 编 辑 1991年，Zhang等[1]首次发现Bu是一种强效的分化诱导剂，10nmol/L Bu作用于红白血病K562细胞，通过细胞形态、还原NBT能力、吞噬乳状颗粒的能力和细胞化学等多项指标检测证实K562细胞向分化型转变，以同样浓度的其他强心甾类化合物如华蟾蜍精、箭毒和毛地黄皂苷配基处理K562细胞，观察到微弱效应或没有作用，提示Bu诱导细胞分化是其抑制Na+K+-ATPase作用以外的一种独特机制。Bu处理其他三株来源于人的白血病细胞系（包括早幼粒白血病HL60细胞、成单核细胞白血病U937细胞和成髓细胞白血病ML1细胞），同样观察到诱导分化的效果[2]，三株细胞均朝单核/巨噬细胞样细胞的方向分化。除了检测上述诱导K562细胞分化的指标以外，流式细胞术（FCM）检测发现，Bu使ML1细胞生长周期中G2期细胞显著减少，U937细胞的S和G2期细胞数目减少，推测Bu主要作用于S期的细胞，对细胞DNA的复制产生影响，而且三株细胞产生Fc受体的能力提高；U937和ML1细胞分别在10nmol/L Bu作用4小时和6小时时发生分化，72小时达到峰值；联用Bu和维甲酸（RA）或者1,25二羟维生素D3或足叶乙甙（VP16）或人γ-干扰素，对U937和HL60细胞分化产生强协同效应，联用Bu和VP16或人肿瘤坏死因子-α（TNF-α），对ML1细胞产生类似作用。 Jing等[3]试图探讨Bu诱导细胞分化的机制：10nmol/L Bu作用ML1细胞24小时，对细胞生长有显著抑制作用，这种作用可持续6天，通过检测各种蛋白激酶活性显示，蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）的活性受到抑制，cdc激酶和酪蛋白激酶-2（CK2）的活力下调，此种通过调节数种蛋白激酶的活性以诱导细胞分化的机制不同于其他的分化诱导剂如RA和1,25二羟维生素D3。FCM检测细胞周期的变化在Bu处理12小时后最为明显，细胞阻滞于G2/M期，Bu对细胞周期的影响类似于拓扑异构酶（Topo）抑制剂的作用，进一步研究发现，Bu处理后，TopoⅡ的活性受到抑制，TopoⅠ的活性不受影响。 3H-Bu和3H-箭毒连接K562实验显示，二者作为配体的饱和度很相似，而3H-Bu比3H-箭毒的亲和力要高。在箭毒耐受细胞中观察到3H-Bu的饱和水平大约是在K562细胞中观察到的一半，但亲和力没有什么改变。当用箭毒预处理K562细胞后，再用3H-Bu处理，Bu同K562的连接被彻底拮抗，该实验说明Bu作用于细胞是通过连接于细胞膜上的位点（也是箭毒的连接位点）实现的，也提示Na+K+-ATPase的抑制与诱导分化的启动是密切相关的。Numazawa小组的研究还发现，Bu诱导细胞分化时，在原癌基因表达改变的早期即发生Na+K+-ATPase的抑制[4]。Bu诱导人单核细胞白血病THP-1细胞分化成巨噬细胞样细胞，推动增殖力和粘附力，NBT还原能力增强，也增强白介素-1的表达。在此过程中Bu下调c-myb和c-myc的表达，诱导c-fos和Egr-1的转录。Bu和箭毒诱导细胞分化、原癌基因表达，在药物浓度方面是相当的。蛋白激酶的抑制因子H7不能抑制Bu介导的c-fos的转录，说明Bu的信号转导机制不同于佛波酯。当培养基中的Na+被Cl-取代，高剂量Bu的细胞毒作用明显消失。在低Na+培养基中，Bu不能诱导c-fos表达和下调c-myb的转录，表明胞内Na+浓度的上升（因为Na+K+-ATPase的抑制）可能触发了Bu激活的原癌基因表达的变化。 Yamada等[5]研究证实，Bu加强RA诱导原代培养的早幼粒白血病细胞的分化作用，单独使用Bu作用于取自急性髓细胞白血病（AML）病人的原代培养的白血病细胞，20例中有4例诱导分化显著，可见Bu单独使用诱导AML细胞分化作用比较温和，而对于急性早幼粒白血病（APL）原代培养细胞，联用Bu和RA表现很强的协同诱导分化作用。在有些病例中，Bu恢复对RA耐受的APL细胞对RA的敏感性，Bu诱导分化的有效浓度比其引起强心作用的浓度要低得多，联合用药比RA单独使用也更为有效。Numazawa等[6]从人的血浆中提取到一种内源的Befallen-like物质，能抑制多种源于人的白血病细胞的生长，该物质被蛋白酶消化或热处理后，其作用依旧存在，诱导THP-1细胞形态和功能发生分化，它与Bu一样也抑制Na+K+-ATPase的活性。因此推测人血浆中这种内源性Na+K+-ATPase抑制剂扮演了诱导细胞分化的角色。 Bufotanine（羟基它里宁)诱导肿瘤细胞凋亡机制 第二篇 细胞凋亡是某些因素诱导的基因介导的细胞自杀行为，组织中的凋亡细胞最终解离为膜完整的凋亡小体，被组织的专职细胞吞噬，由于细胞内容物不泄漏，因而没有炎症反应。诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的新思路。1994年，Jing等[7]用10nmol/L及以上浓度Bu处理HL60、ML1和U937细胞，观察到细胞皱缩、染色质凝聚、碎裂、凋亡小体形成等凋亡细胞形态学改变，FCM分析细胞DNA含量，检测到DNA断裂丢失所致；DNA琼脂糖凝胶电泳得到DNA梯形条带，因为细胞染色质沿核小体之间断裂，形成180bp及其倍数的DNA片段。HL-60细胞DNA的合成和TopoⅡ活性受到明显抑制，Bu的有效浓度比其他抗肿瘤药物如是非曲直铂、VP16和RA的浓度要低得多；用1μmol/L Bu处理人正常单核细胞和多形核细胞24小时，没有观察到细胞凋亡，结果表明Bu选择性抑制肿瘤生长与诱导细胞凋亡密切相关。Masuda等[8]应用1μmol/L Bu处理HL60细胞15分钟，然后撤Bu，继续培养15小时，检测到细胞生存率下降和DNA梯形条带，提示Bu处理后，细胞凋亡的信号立即启动。用100nmol/L Bu预处理HL60细胞6小时，增强了顺铂和RA诱导凋亡作用[10]。 Bu诱导细胞凋亡的机制受到重视。Watabe等[10]认为Bu诱导的细胞凋亡与丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）的活化密切相关。Bu处理无血清培养的U937细胞6小时，MAPK显著升高，接续12小时。MAPK活性升高之前，检测到Ras、Raf-1和MAPK激酶（MAPKK）依次激活，信号传导的途径可能是Ras→Raf-1→MAPKK→MAPK；与此同时，细胞内cAMP浓度显著下降，示Raf-1也被PKA磷酸化程度的下降而激活。事实上，用已知的能刺激升高细胞内cAMP的信号物质forskolin预处理细胞，再用Bu处理，导致Raf-1活性和DNA片段化水平都下降；用MAPKK-1的反义cDNA转染U937细胞，再用Bu处理，不再发生DNA片段化和死亡，MAPK的持续激活是Bu诱导凋亡所必需的。Bu激活JNK（c-jun N 端蛋白激酶，MAPK家族的成员之一），诱导U937细胞凋亡支持上述结论[11]。 Bu诱导的细胞凋亡被内源性核酸内切酶抑制剂（Zn2+）所抑制，而不受蛋白质合成抑制剂的抑制，说明Bu诱导的细胞凋亡过程不需要新的蛋白质的合成，经Northern Blot分析显示c-myc和bcl-2基因表达随作用时间的延长而下降，证明Bu诱导细胞凋亡是通过改变凋亡相关基因的表达实现的[8]。抗凋亡基因bcl-2的过表达产物通过抑制MAPK活性从而抑制Bu诱导的细胞凋亡[12]。Bu活化了激活蛋白-1（AP-1），而AP-1的活性在bcl-2过表达细胞株中下降40%，推测bcl-2作用于MAPKK-1的下游和MAPK的上游，通过抑制MAPK的活性来下调AP-1的转录活性，从抑制凋亡进程。 酪蛋白激酶2（CK2）在Bu诱导的细胞凋亡过程中也扮演重要角色[13]，Bu处理U937细胞，伴随CK2到峰值，9小时时显著下降；CK2与TopoⅡ-α复合物的数量在Bu处理之初即升高，6小时达到最大值。结果提示复合物中的TopoⅡ-α被移位的CK2磷酸化，这种磷酸化调节TopoⅡ活性，U937凋亡细胞在药物处理9—12小时出现，似乎是Bu信号通过CK2移位被转导到核内，CK2与TopoⅡ-α形成复合物调节该酶的活性，导致细胞凋亡。Hashimoto等[9]也发出Bu作用于HL60细胞，TopoⅡ-α、TopoⅡ-β的数量和TopoⅡ的活性在100nmol/L处理18小时几乎检测不到，Bu引起TopoⅡ-α mPNA的下降导致TopoⅡ-α数量和活性的下降，导致细胞凋亡。 最近，有人应用差异显示（DD）技术克隆与Bu作用相关的基因。MmGowan等[14]克隆了一受Bu下调的基因14-3-3，其产物14-3-3蛋白是一种多功能调节蛋白，该蛋白各种同分异构体数量的下降对细胞的功能产生重要影响。Kawazoe等[15]克隆了一个调节Bu诱导细胞凋亡的基因Tiaml，为探讨Tiaml在细胞凋亡中的作用，分别观察Bu对表达正义或反义Tiaml RNA的U937细胞株的诱导凋亡作用，前者诱导了凋亡，后者缺如；正义链转染细胞株中，p21激活蛋白激酶（PAK）和JNK的活性升高，证明Tiaml基因在Bu诱导的细胞凋亡过程中起关键作用。 Bufotanine（羟基它里宁） 阻断瘤体血管机制 抑制肿瘤的血管生成是肿瘤治疗的新策略。Lee等[16]用原代培养的牛主动脉内皮细胞在Ⅰ型胶原蛋白三维培养基中生成的毛细管样网络结构为模型，观察Bu对血管生成的影响。经图像分析仪定量检测，5nmol/L Bu即可显著抑制毛细管的生成；FCM分析可见血管内皮细胞阻滞于G2/M期，细胞增殖受到抑制。是目前发现阻断肿瘤血管生成最强的活性成份。并且无毒副作用。 |
